簡述酶聯(lián)免疫斑點檢測ELISpot將細胞培養(yǎng)與免疫檢測原理相結(jié)合實現(xiàn)了在單細胞水平對細胞因子分泌頻率的直接定量分析。該技術(shù)能夠從數(shù)十萬個細胞中檢測出單個分泌目標因子的細胞在疫苗免疫應(yīng)答評價、感染性疾病監(jiān)測及腫瘤免疫研究中具有不可替代的價值。一、ELISpot的技術(shù)原理與工作流程一細胞因子原位捕獲ELISpot實驗在預(yù)包被了特異性捕獲抗體的PVDF微孔板中進行。將待測細胞如外周血單核細胞或腫瘤浸潤淋巴細胞與特定刺激物抗原肽段、絲裂原等共孵育后活化的細胞在局部環(huán)境中分泌細胞因子這些因子隨即被孔底緊鄰的捕獲抗體立即結(jié)合。二免疫酶學(xué)放大與斑點形成洗去細胞后加入生物素標記的檢測抗體針對不同表位的二抗形成捕獲抗體-細胞因子-檢測抗體夾心復(fù)合物。隨后加入酶標記的親和素如堿性磷酸酶標記的鏈霉親和素在底物如BCIP/NBT作用下酶催化反應(yīng)在抗體結(jié)合位點附近形成不溶性紫色沉淀最終產(chǎn)生一個清晰可辨的斑點。三結(jié)果判讀與定量每個斑點代表一個分泌該細胞因子的細胞。通過人工計數(shù)或自動斑點分析系統(tǒng)可獲得每孔中陽性斑點的總數(shù)從而計算出分泌目標細胞因子的細胞頻率如每百萬細胞中陽性細胞數(shù)。二、ELISpot相比ELISA的核心優(yōu)勢一功能層面的本質(zhì)不同ELISA通過顯色反應(yīng)測定上清液中積累的可溶性蛋白總量反映的是分泌了多少而ELISpot直接可視化單個細胞分泌行為回答的是有多少細胞在分泌。這一區(qū)別在疫苗免疫應(yīng)答監(jiān)測中尤為重要——關(guān)鍵指標是抗原特異性T細胞的數(shù)量而非每個細胞分泌的絕對量。二單細胞水平的超高靈敏度ELISpot能從20萬至30萬細胞中檢出1個分泌特定細胞因子的細胞這一靈敏度遠高于ELISA檢測下限通常在皮摩爾級。常規(guī)流式細胞術(shù)檢測胞內(nèi)細胞因子需細胞活化數(shù)小時并可能因細胞通透處理丟失信號ELISpot實時捕獲分泌的細胞因子更真實反映細胞功能。三動態(tài)功能信息的高效獲取與僅提供轉(zhuǎn)錄本豐度的RNA檢測技術(shù)不同ELISpot直接測量蛋白質(zhì)水平的細胞效應(yīng)功能且以單細胞頻率為計量單位為評估疫苗誘導(dǎo)的T細胞免疫提供了量化指標。三、ELISpot的關(guān)鍵實驗要點一捕獲抗體的選擇與預(yù)包被高質(zhì)量、高親和力、低內(nèi)毒素的捕獲抗體是確保特異性和低背景的基礎(chǔ)。預(yù)包被需均勻且充分避免邊緣效應(yīng)。二細胞數(shù)量的優(yōu)化與刺激條件細胞接種密度的確定需保證孔底單層分布。刺激物抗原肽、多克隆刺激劑或特異性抗原的濃度、孵育時間和溫度需根據(jù)實驗?zāi)康暮图毎愋瓦M行預(yù)實驗優(yōu)化。三斑點顯色的控制與背景管理顯色反應(yīng)需精確掌控時長過度顯色會導(dǎo)致背景升高或斑點融合。設(shè)陰性對照無刺激物和陽性對照多克隆刺激劑是監(jiān)控實驗條件的基本要求。四、ELISpot的典型應(yīng)用場景一疫苗免疫應(yīng)答評價在艾滋病疫苗、乙肝疫苗、腫瘤疫苗等研發(fā)中ELISpot被廣泛用于檢測抗原特異性T細胞頻率是評估疫苗免疫原性的核心指標之一。二感染性疾病研究ELISpot可用于結(jié)核感染診斷T-SPOT.TB技術(shù)即基于ELISpot原理通過檢測結(jié)核特異性抗原刺激下釋放IFN-γ的T細胞數(shù)量輔助診斷潛伏性結(jié)核感染。此外在病毒性肝炎、HIV感染等研究中ELISpot也被用于監(jiān)測特異性T細胞應(yīng)答的動態(tài)變化。三腫瘤免疫與細胞治療在腫瘤浸潤淋巴細胞研究和CAR-T細胞治療中ELISpot用于評估效應(yīng)細胞對腫瘤抗原的特異性反應(yīng)強度。雙色或FluoroSpot技術(shù)可同時檢測同一細胞分泌的多種細胞因子如IFN-γ和IL-2提供更豐富的功能表型信息。